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    技術專欄

    WB實驗之內參選擇
    供稿:市場部發布時間:2023-06-14瀏覽量:279次

    免疫印跡(Western Blot)在研究蛋白相關實驗中是關鍵技術,由于實驗周期較長、步驟繁瑣,影響因素較多,在實驗過程中經常會遇到各種難題。我們需要追根求源,查找并修復問題。今天我們講解下WB實驗中內參的選擇。

    什么是內參及內參的作用

    內參即是內部參照(Internal control),是指在組織和細胞中表達相對穩定的一類蛋白質,通常由管家基因編碼。這些蛋白質被用作檢測蛋白表達水平變化時的參照物,以確定實驗的準確性和可重復性。

    在Western Blot實驗中,我們使用內參其實就是使用與內參對應的抗體來檢測內參的表達量。由于內參在不同組織和細胞中的表達量相對穩定,通過檢測每個樣品內參的表達量,我們可以校正上樣誤差,從而獲得更可靠的半定量結果。使用內參還可以作為空白對照,檢測蛋白轉膜情況是否完全,并檢查該實驗中的顯色或發光體系是否正常。通過選擇合適的內參,可以將這些樣本之間的差異消除或最小化,減少實驗誤差,提高結果的可靠性和可重復性。因此,選擇合適的內參是Western Blot實驗的關鍵步驟之一。

     

    如何選擇合適內參

    樣本種屬來源

    根據所做的蛋白樣本的種屬確定,哺乳動物一般β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等;植物樣本一般選擇Plant actin、Rubisco等;其他來源樣本應參考文獻報道選合適蛋白作為內參。

    蛋白表達位置

    根據研究對象的不同,選擇不同的內參對于檢測細胞中不同位置的蛋白非常重要。一般情況下,選擇β-actin和GAPDH作為總蛋白的內參就可以滿足要求。然而,對于細胞質、細胞核、細胞膜等不同位置的蛋白檢測,我們需要選擇相應的內參,以確保實驗結果具有科學性和可靠性。常用內參抗體分子量及其定位情況如下:

    a.胞漿和全細胞蛋白:β-actin(43kDa)、GAPDH(37kDa)、Tubulin(55kDa)等;

    b.核蛋白:PCNA(29kDa)、Histone H3(17kDa)、Lamin B (66kDa) 等;

    c.胞膜蛋白:Na+/K+-ATPase(100kDa)等;

    d.線粒體蛋白:COX IV(17kDa)、VDAC1(30kDa)等。

    目的蛋白分子量

    在選擇內參抗體時應考慮目的蛋白分子量大小,通常要求目的蛋白與內參蛋白分子量相差5kDa以上。例如,若檢測的目的蛋白分子量為45kDa,則不宜選擇分子量為42kDa的β-actin作為內參,應考慮選擇分子量為36kDa的GAPDH作為內參。

    實驗環境影響

    在實際的實驗環境中,處理條件可能會影響一些內參的表達,因此需要考慮研究的信號通路是否會對內參的表達產生影響。例如,在糖代謝的研究中,不能使用GAPDH作為內參,因為GAPDH是參與糖酵解過程中的酶,在某些細胞中,缺氧等條件會改變GAPDH的表達;在凋亡實驗時,Lamin等也不適合作為內參;在加入抗有絲分裂和抗真菌藥物時,Tubulin的表達易受影響,不適合作為內參等。因此,在設計實驗方案的時候應考慮這些因素并參考相關文獻,在實驗過程中,還需要留意內參表達是否出現異常等因素的考慮。

    不同的組織特異性

    actin 即肌動蛋白,是細胞的一種重要骨架蛋白。actin 大致可分為六種,其中四種是不同肌肉組織特異性的,包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin,其余兩種廣泛分布于各種組織中,包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的,在肌肉組織中beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此,不同的組織應選擇不同的內參,不能一概而論。

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